描述

支原体检测试剂盒-科研版

【产品货号及规格】

BPM 20-01 20 T/盒

【产品说明】

支原体(Mycoplasma)：目前发现的最小的原核生物，据统计约 15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。

本产品试剂盒采用多套引物探针在 FAM 通道检测支原体 DNA，采用一套引物探针在 VIC 通道检测内参 DNA，检测对象为细胞培养的上清液或细胞本身。该试剂盒具有以下特点：

稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

可靠：含内参基因，避免假阴性。

方便：操作简单，无需电泳步骤。

定量：以 Ct 值判断，可定量检测。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输，-20 ℃保存，有效期 1 年。

【产品组分】

注：本试剂盒提供试剂，使用前先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。

【操作步骤】

1.试剂的复溶

Biowing^®MyPrimer&Probe Mix2 先12,000 rpm离心5 min，再用179 μL/管RNase Free Water复溶，混匀1 min ，瞬离，并常温放置5-10 min后备用。

2.样本制备（自备）

样本可直扩，具体操作方法见附录2。

3.qPCR 反应体系及条件反应体系以20 µL为例：

1. 震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
2. 向每孔反应管中分装 18 μL qPCR Mix。
3. 向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 μL石蜡油。
4. 向反应管中穿过石蜡油层加样，3000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：

PCR 仪设置

以ABI 7500为例，选择TaqMan 探针法：

注：建议其他不同类型样本，先做适应性验证，因为不同样本杂质性质不同。

【阈值设置】

以ABI 7500为例，扩增曲线选择 log 法，基线设置 3~15 个循环。

1.内参(VIC)阈值设定：以阴性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的 Ct 值定为 30±3。

2.支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的 Ct 值定为 26±3。

【结果判读】

根据支原体(FAM) Ct 值判定是否发生支原体污染，具体标准如下：

注：检测结果与其他方法检测结果矛盾时：

1.检查内参通道扩增是否正常，扩增曲线是否选择 log 法。

2.内参扩增不正常，表明 PCR 反应未正常进行，PCR 体系受到干扰，需重复检测。

3.内参扩增正常，结合 Ct 值和扩增曲线形态判断。

4.无典型扩增曲线，可认为该样本为支原体阴性。有典型扩增曲线，需重复检测。重复结果不一致判为阴性；结果一致，判为阳性。

【注意事项】

由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生 DNA 污染：

1.建议阳性对照与待测样本、阴性对照在实验室的不同区域进行添加，在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。

2.建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。

3.试剂盒开启后，阳性对照应与试剂 Mix、阴性对照分开存放。

4. qPCR 封膜时须反复压紧。

5.实验室环境须定期清除支原体。

【附录 1 可检测支原体种类】

序号	拉丁文系统名	序号	拉丁文系统名
1	Acholeplasma hippikon	61	Mycoplasma synoviae
2	Acholeplasma laidlawii	62	Mycoplasma testudineum
3	Acholeplasma oculi	63	Mycoplasma testudinis
4	Acholeplasma pleciae	64	Mycoplasma timone
5	Candidatus Mycoplasma girerdii	66	Mycoplasma tullyi
6	Mycoplasma alkalescens	67	Mycoplasma verecundum
7	Mycoplasma alvi	68	Mycoplasma vulturii
8	Mycoplasma anseris	69	Mycoplasma zalophi
9	Mycoplasma anserisalpingitidis	70	Mycoplasmopsis agassizii
11	Mycoplasma arginini	71	Mycoplasmopsis alligatoris
12	Mycoplasma arthritidis	72	Mycoplasmopsis anatis
13	Mycoplasma auris	73	Mycoplasmopsis arginini
14	Mycoplasma bovoculi	74	Mycoplasmopsis bovirhinis
15	Mycoplasma buccale	75	Mycoplasmopsis canis
16	Mycoplasma canadense	76	Mycoplasmopsis citelli
17	Mycoplasma cloacale	77	Mycoplasmopsis columbinum
18	Mycoplasma conjunctivae	78	Mycoplasmopsis cricetuli
19	Mycoplasma crocodyli	79	Mycoplasmopsis cynos
20	Mycoplasma dispar	80	Mycoplasmopsis edwardii
21	Mycoplasma elephantis	81	Mycoplasmopsis felis
22	Mycoplasma enhydrae	82	Mycoplasmopsis fermentans
23	Mycoplasma equigenitalium	83	Mycoplasmopsis gallinacea
24	Mycoplasma falconis	84	Mycoplasmopsis mustelae
25	Mycoplasma faucium	85	Mycoplasmopsis pullorum
26	Mycoplasma felis	86	Mycoplasmopsis pulmonis
27	Mycoplasma flocculare	87	Mycoplasmopsis verecunda
28	Mycoplasma gallisepticum	88	Ureaplasma diversum
29	Mycoplasma gateae	89	Ureaplasma felinum
30	Mycoplasma genitalium	90	Ureaplasma urealyticum
31	Mycoplasma gypis	91	Mycoplasma feliminutum
32	Mycoplasma hominis	92	Mycoplasma suis
33	Mycoplasma hyopharyngis	93	Mycoplasma parvum
34	Mycoplasma hyorhinis	94	Mycoplasma wenyonii
35	Mycoplasma hyosynoviae	95	Mycoplasma cottewii
36	Mycoplasma imitans	96	Mycoplasma putrefaciens
37	Mycoplasma indiense	97	Mycoplasma yeatsii
38	Mycoplasma leocaptivus	98	Mycoplasma amphoriforme
39	Mycoplasma leonicaptivi	99	Mycoplasma ovis
40	Mycoplasma lipophilum	100	Mycoplasma insons
41	Mycoplasma marinum	101	Mycoplasma erythrodidelphis
42	Mycoplasma moatsii	102	Mycoplasma bradburyae
43	Mycoplasma mobile	103	Mycoplasma haemolama
44	Mycoplasma nasistruthionis	104	Mycoplasma coccoides
45	Mycoplasma neophronis	105	Mycoplasma kahanei
46	Mycoplasma orale	106	Mycoplasma seminis
47	Mycoplasma ovipneumoniae	107	Mycoplasma phocoeninasale
48	Mycoplasma oxoniensis	108	Mycoplasma phocoenae
49	Mycoplasma penetrans	109	Mycoplasma miroungirhinis
50	Mycoplasma phocicerebrale	110	Mycoplasma seminis
51	Mycoplasma phocidae	111	Mycoplasma hyopneumoniae
52	Mycoplasma pirum	112	Spiroplasma citri
53	Mycoplasma pneumoniae	113	Mycoplasma capricolum
54	Mycoplasma pulmonis	114	Mycoplasma corogypsi
55	Mycoplasma salivarium	115	Mycoplasma procyoni
56	Mycoplasma sp. Phocoena	116	Mycoplasma iguanae
57	Mycoplasma sphenisci	117	Mycoplasma feriruminatoris
58	Mycoplasma struthionis	118	Mycoplasma hafezii
59	Mycoplasma sualvi	119	Mycoplasma buteonis
60	Mycoplasma subdolum	120	Mycoplasma mycoides

 

【附录 2 样本直扩的操作方法】

样本的简易快速制备方案(直扩）：可用于细胞培养上清、细胞悬液、血液，样本制备步骤如下：

1.细胞培养上清：取 1~1.5 mL 细胞培养上清；500 rpm 离心 3  min；取 2 µL 上清作为模板进行qPCR 反应。

2.细胞悬液：取 2 µL 细胞悬液作为模板进行qPCR 反应。要求样本内细胞总数量不超过 10000 个，样本可用细胞培养基稀释。

3.血液：取血液样本作为模板进行 qPCR 反应。注意血液中的细胞对 PCR 反应有较强抑制作用，内参检测通道会显示异常。建议用无菌水稀释 10 倍，充分混匀后，取 2 µL作为模板进行 qPCR 反应。