描述

1/产品概述

本试剂盒适用于从血液、组织、粪便等多种样本中快速提取高纯度的病毒、细菌、真菌 DNA/ RNA。试剂盒采用独特样本处理方案 ，搭配核酸保护剂可显著提高微量核酸的回收率及严格质控抽提过程。经过硅胶膜的特异性吸附 ，可快速高效纯化病毒、细菌 、真菌 DNA/RNA。 样本兼容性广 ，获得的核酸得率高 ，纯度高 ，可直接用于逆转录、PCR、荧光定量PCR等下游相关实验。

02/产品组分

 

	组分	PRE.M/R -001 (50 rxns)
BOX 1	通用裂解液 粪便专用裂解液	35 ml 35 ml
BOX 2	核酸保护剂 溶解液 Proteinase K	1.5 ml 1.2 ml
BOX 3	Buffer 裂解液 Buffer 清洗液1 Buffer 清洗液2 RNase-free ddH2O DNA/RNA Columns (each in a 2 ml Collection Tube) RNase-free Collection Tubes 1.5 ml	18 ml 27 ml 9 ml 6 ml  50个 50个

通用裂解液：裂解血液、组织等样本 ； 粪便专用裂解液 ：裂解粪便样本 ；

核酸保护剂 ：提高微量核酸的回收率及严格质控抽提过程 ； 溶解液 ：复溶核酸保护剂 ；

Proteinase K ：消化蛋白质 ；

Buffer 裂解液 ：裂解样本并提供核酸结合条件 ； Buffer清洗液1 ：去除残留蛋白和其他杂质 ；

Buffer清洗液2 ：去除残留盐离子 ；

RNase-free ddH2O ：洗脱吸附膜上的DNA/RNA ； DNA/RNA Columns ：特异性吸附DNA/RNA ；

Collection Tubes 2 ml ：收集滤液 ；

RNase-free Collection Tubes 1.5 ml ：收集DNA/RNA。

 

03/保存条件

BOX 1 ：15 ~ 25℃保存 ，室温运输 ；

BOX 2 ：-30 ~ -15℃保存 ， ≤0℃运输 ；

BOX 3 ：15 ~ 25℃保存 ，室温运输。

 

04/适用范围

可用于以下样本病毒、细菌、真菌DNA/RNA提取

 

 

样本类别	样本名称
血液	全血、血清、血浆
组织	肝脏、肺、气管等
粪便	粪便、盲肠内容物
其他	粉尘及垫料、 口腔拭子等

 

 

05/自备材料

无水乙醇、β-巯基乙醇、Lysozyme，RNase-free 吸头、1.5 ml RNase-free离心管、离心机、 研磨破碎仪、涡旋振荡仪、移液器等。

 

06/注意事项

1. 首次使用前 ，请参照瓶上标签在通用裂解液中加入指定量的β-巯基乙醇 ，核酸保护剂中加入指 定量的溶解液 ，Buffer 清洗液 1 与 Buffer 清洗液 2 中加入指定量的无水乙醇 ，并进行标注。

组分	加入量
通用裂解液	1 %终浓度
核酸保护剂	1.5ml
Buffer 清洗液1	18 ml
Buffer 清洗液2	36 ml

▲通用裂解液加入β-巯基乙醇后可在2 ~ 8℃保存1个月 ，建议按照用量现配现用。通用裂解液在储存 时可能会形成沉淀 ，如果有沉淀出现 ，请于60℃加热溶解 ，然后待恢复至室温后使用。

2. 试剂盒中含有低温组分 Proteinase K ，收到后应置于-30 ~ -15℃保存。
3. 试剂盒中含有低温组分核酸保护剂 ，使用前请用试剂盒中溶解液进行复溶 ，使用前充分 混匀 ，按照实际使用情况分装到RNase-free的离心管中 ，并置于-30 ~ -15℃保存 ，避免反复 冻融。
4. 样本使用前需平衡至室温。
5. 所有操作步骤 ，均在室温(15 ~ 25℃)下进行。
6. 病毒具有较强的感染能力 ，操作前必须做好各种防御措施。
7. 样本禁止反复冻融 ，避免提取的病毒DNA/RNA降解或产量下降。
8. 使用本试剂盒时 ，请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩 ，使用RNase-free耗材等 ， 最大程度避免RNase污染。

 

07/实验原理与流程概要

 

裂解样本 ：参考08-1进行样本前处理 ，后续依次加入 300 μl Buffer 裂解液、核酸保护剂、300 μl 前处理液涡旋混匀 ，室温静置5 min

调节结合条件 ：加入200 μl无水乙醇 ，涡旋混匀15 – 30 sec ，短暂离心收集管盖 及管壁上的液体

吸附核酸 ：转移混合液至DNA/RNA Columns ，12,000 rpm (13,800 × g)离心

1 min

去除杂质 ： 加入700 μl Buffer清洗液1(已加入无水乙醇) ，12,000 rpm (13,800 × g)离心30 sec；加入700 μl Buffer清洗液2(已加入无水乙醇) ，12,000 rpm (13,800 × g )离心30sec， 12,000rpm（13，800× g）空柱离心2min

 

洗脱DNA/RNA：加入30 – 50 μl RNase-free ddH2O  ，12,000 rpm (13,800 × g) 离心1 min

 

 

08/实验流程  08-1/样本前处理

◆血液：将研磨管加好研磨珠后，取 100 μl血液(如样本量不足，使用PBS或生理盐水补足至  100 μl)及700 μl 通用裂解液加入其中，震荡混匀后上机研磨；将研磨好的样本12,000 rpm 5 min离去浮末，接着加入 300 μl 20 μg/μl的Lysozyme溶液 ，震荡混匀后置于金属浴37 ℃    震荡孵育 1h-1h 30min；接着加入20 μl Proteinase K，56℃孵育10 min。

◆组织：将研磨管加好研磨珠后，称取20-50 mg组织样本加入，继而加入700 μl 通用裂解液， 震荡混匀后上机研磨；将研磨好的样本12,000 rpm 5 min离去浮末，接着加入 300 μl 20

μg/μl的Lysozyme溶液，震荡混匀后置于金属浴37 ℃震荡孵育 1h-1h 30min；接着加入20 μl Proteinase K，56℃孵育10 min。

◆粪便：取2-3粒粪便或20-30 mg盲肠内容物加入到1.5 ml离心管中，加入700 μl 粪便专用     裂解液，震荡混匀15 s后静置10 min，瞬时离心，取上清液加入到已加入研磨珠的研磨管中， 上机研磨；将研磨好的样本12,000 rpm 5 min离去浮末，接着加入 300 μl 20 μg/μl的

Lysozyme溶液，震荡混匀后置于金属浴37 ℃震荡孵育 1h-1h 30min；接着加入20 μl Proteinase K，56℃孵育10 min。

◆粉尘及垫料等其他样本：用2-3个洁净棉签在动物房通风橱口或集尘板上刮去灰尘或取3-5颗玉米芯垫料，将取好灰尘的棉签头或玉米芯垫料置于700 μl 通用裂解液中，震荡混匀后瞬时离心；吸取粉尘上清液或玉米芯垫料上清，加入到加好研磨珠的研磨管中，震荡混匀后上机研磨；将研磨好的样本12,000 rpm 5 min离去浮末，接着加入300 μl 20 μg/μl 的Lysozyme溶液，震荡混匀后置于37℃震荡孵育 1h-1h 30min；接着加入20 μl Proteinase K，56℃孵育10 min。

 

 

08-2/DNA/RNA提取

以下过程均在生物安全柜中进行

1. 向RNase-free管中依次加入300 μ l Buffer 裂解液、25 μl 核酸保护剂、300 μl Buffer 前处理液 ， 涡旋混匀15 – 30 sec ，短暂离心收集管盖及管壁上的液体 ，室温静置5 min。
2. 加入200 μl 无水乙醇 ，涡旋混匀15 – 30 sec ，短暂离心收集管盖及管壁上的液体。

▲若此时有杂质沉淀 ，属正常现象 ，可直接进行后续实验。

3. 将上述混合液全部转移至DNA/RNA Columns (DNA/RNA Columns 已放入收集管) ， 12,000 rpm (13,800 × g)离心1 min ，弃滤液。
4. 向DNA/RNA Columns中加入700 μl Buffer 清洗液1(请先检查是否已加入无水乙醇) ， 12,000 rpm (13,800 × g)离心30 sec ，弃滤液。
5. 向DNA/RNA Columns中加入700 μl Buffer 清洗液2 (请先检查是否已加入无水乙 醇) ， 12,000 rpm ( 13,800 × g)离心30 sec ，弃滤液。
6. 12,000rpm ( 13,800 × g)空柱离心2 min。
7. 小心将DNA/RNA Columns转移至新的RNase-free Collection Tubes 1.5 ml (试剂盒提供) 中，向膜中央悬空加入30 – 50 μl的RNase-free ddH2O ，室温静置1 min ，12,000 rpm(13,800× g)离心1 min。
8. 弃去DNA/RNA Columns ，提取的DNA/RNA可直接用于后续检测 ，短期保存请置于-30 ~

-15℃ , 长期保存请置于-85 ~ -65℃。

 

 

9/常见问题与解决方案

 

常见问题	原因	解决方案
未提取到 DNA/RNA或 产量低	1.样本反复冻融	使用新鲜样本 ，避免反复冻融
	2.核酸保护剂储存不当	核酸保护剂应预先分装后置于-30 ~ -15℃保存 ，避免反复冻融
	3.洗脱不充分	RNase-free ddH2O加至膜中央 ，适当减少洗脱体积 ，可于65℃ 预热 ，延长静置时间或进行二次洗脱
	4.样本未恢复至室温	样本先恢复至室温 ，再进行核酸提取
	5.离心温度不当	使用室温条件离心
下游结果不 理想	1.盐离子残留	沿吸附柱管壁四周加入Buffer 洗脱液2 ，或加入Buffer 洗脱液2 后盖盖颠倒混匀2 – 3次 ，有助于完全冲洗管壁上的盐分
	2.乙醇残留	空柱离心后 ，打开吸附柱盖子室温静置5 min ，最大程度去除乙 醇残留
	3.试剂准备有误	使用前按照标签提示 ，分别向Buffer洗脱液1、Buffer 洗脱液2加 入相应的无水乙醇