描述

SPF级大小鼠病原体质量控制多重qPCR检测试剂盒（2种常见病毒检测项目）

（探针法）

【产品规格】

SPF.M/R-CV-001 50 T/盒

【产品说明】

Biowing^®SPF级大小鼠常见病毒qPCR检测试剂盒，针对实验小鼠易感的两种病毒小鼠肝炎病毒和小鼠诺如病毒而设计。

本试剂盒采用两套引物探针在FAM（小鼠肝炎病毒MHV）、HEX（小鼠诺如病毒MNV）两个通道检测两种病毒，另外采用一套引物探针在CY5通道检测内参RNA，该试剂盒具有以下特点：

灵敏：检测灵敏度较高，10 copies/μL可被有效检出。

稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

可靠：含内参对照，避免假阴性。

方便：操作简单，一步法检测。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输，-20℃保存，有效期1年；使用后仍存放在-20℃，不可反复冻融超过三次。

【产品组分】

A BOX:

组分名称	装量
Biowing®Virus qPCR Reaction Mix	110 μL×2管
Biowing®Common Virus（MHV、MNV） Primer&Probe Mix	冻干粉×2管
RNase Free Water	1.1 mL×2管
石蜡油	1.1 mL×1管

B BOX:

组分名称	装量
阳性质控（PC）	冻干粉×2管
RNase Free Water	1.1 mL×1管

注：

阳性质控（PC）包含3种病毒核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是小鼠肝炎病毒MHV、小鼠诺如病毒MNV、内参RNA。

【操作步骤】

1.  样本制备

推荐配套使用翼和SPF-Level Mouse/Rat Pathgen DNA/RNA Kit Pro（货号：PRE.M/R-001），此试剂盒提取快速，回收率较高，并提供核酸保护剂（含内部质控），可以对提取过程进行质控，若使用其他提取试剂盒需先自行测试。

2.  产品组分的复溶

A BOX：Biowing^®Required Virus Primer&Probe Mix先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5 s，室温放置5-10 min备用。

A BOX：	每管需加入RNase Free Water量
Biowing®Common Virus（MHV、MNV）Primer&Probe Mix	302 μL
注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。

B BOX：阳性质控（PC）先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5s，室温放置5-10 min后备用。

B BOX：	每管需加入RNase Free Water量
阳性质控（PC）	44 μL
注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；阳性质控务必与A BOX分开保存，防止污染，复溶后立即通风并喷洒酒精，以防气溶胶污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。

3.  qPCR 反应液的准备

（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做单孔。

反应孔数=1个阳性质控+1个阴性质控+样本数

（2）根据反应孔数计算所需的Biowing^®Virus Probe qPCR Mix总量（需有1孔的加样损失量）：

Biowing^®Virus Probe qPCR Mix=（反应孔数+1）×15 μL

（3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备qPCR Mix：

组分/样品管	Biowing®Virus qPCR Reaction Mix (µL)	Biowing®Common Virus（MHV、MNV）Primer&Probe Mix (µL)	总体积 (µL)
1孔	4	11	15
N孔 （反应孔数+1）	4N	11N	15N

4.  qPCR 反应体系及反应条件

（1）震荡混匀Biowing^®Virus Probe qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

（2）向每孔反应管中分装15 μL qPCR Mix。

（3）向分装过qPCR Mix的反应管中加入15 μL石蜡油。

（4）向反应管中加入样品，3,000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：

组分/样品管	待测样品管 (µL)	阳性对照管 (µL)	阴性对照管 (µL)
Biowing®Virus Probe qPCR Mix	15	15	15
RNase Free Water	0	0	5
Sample	5	0	0
阳性质控（PC）	0	5	0

PCR仪设置以宏石SLAN-96S为例，先新建并保存程序项目，选择定性/绝对定量模式，反应体系20 µL，选择FAM、HEX、CY5通道，按照下表设置程序进行保存：

步骤		循环数	温度	时间
1	逆转录	1	55℃	15 min
2	预变性	1	95℃	30 s
3	变性	40	95℃	10 s
	退火与延伸		60℃	30 s
60℃延伸时收集荧光信号
通道选择：样本检测通道-FAM、HEX；内参检测通道-CY5。宏石SLAN-96S荧光定量 PCR 仪不需 ROX 校准。若存在部分荧光定量PCR仪无CY5通道，即不分析该通道。

【阈值设置】

以宏石SLAN-96S为例，常用选项中扩增曲线算法选择相对荧光值法-log，基线设置3-15个循环。

（1）按照机器的自动阈值或者手动调整阈值线将阳性质控（PC）各通道的Ct值定为≤32，根据该阈值线进行检测样本结果的判定。

【结果判读】

以宏石SLAN-96S为例，根据样本（FAM/HEX）Ct值判定是否发生病毒感染，具体标准如下：

PCR 模板	样本（FAM/HEX）	判定说明
阳性对照	≤32	阳性成立
	＞32	阳性不成立
待测样品	＞40	阴性成立
	≤40	阳性成立

注：

1. 阳性判断标准为：

（1）FAM通道Ct值≤40时，样本感染小鼠肝炎病毒。

（2）HEX通道Ct值≤40时，样本感染小鼠诺如病毒。

（3）不同机器的检测灵敏度不同，不同类型样本性质不同，建议使用该系列试剂盒检测样本前，利用SPF样本进行适应性验证后制定阳性判断标准。

2. 检查内参通道扩增是否正常，内参扩增不正常，表明核酸抽提过程有误或者PCR反应未正常进行，需重复检测。

【注意事项】

由于PCR反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生核酸污染。

1. 建议分区操作

（1）A区：（洁净区）配制Mix和qPCR阴性加样，建议在超净工作台完成，并配套干净器具及无菌无酶耗材专用于体系配制。

（2）B区：（核酸提取及加样区）样本DNA/RNA提取，建议在超净工作台完成，若无超净工作台请通风状态下提取并立即消杀，需配套专用于核酸提取的器具，并在每次提取后对环境和器具进行核酸消杀处理；加样区，按照先加待测样本，后加阳性对照的顺序加样，在qPCR反应板上阳性对照的排布应远离待测样本孔和阴性对照；同样需配套专用于加样的仪器，并在每次加完样后进行核酸消杀处理。

（3）C区：（核酸扩增区）此区域放置荧光定量PCR仪及相关电脑进行数据处理，同样需定期进行核酸消杀。

2. 其他

（1）由于B BOX含阳性质控，为避免试剂受到核酸污染，A、B BOX请分开储存。

（2）每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。

（3）qPCR反应板封膜或盖盖子时需反复压紧。

（4）上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底。

（5）盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

有技术问题，欢迎电话咨询：021-33559491