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大小鼠选检病原菌检测试剂盒 （联检/鉴定，7种）
（国标病毒选检七项）病毒选检联检试剂盒产品目录
描述
SPF级大小鼠病原体质量控制多重qPCR联检试剂盒（国标病原菌选检七项）
（探针法）
【产品规格】
SPF.M/R-OB-001 50 T/盒
【产品说明】
Biowing®SPF级大小鼠国标选检病原菌qPCR联检试剂盒，采用高灵敏度和特异性的探针法qPCR技术，专为在多种样本类型中快速、高灵敏地筛查SPF级实验室大小鼠常见的7种病原菌而设计。
本试剂盒采用Taqman荧光定量PCR技术，设计7套引物探针分别在FAM（金黄色葡萄球菌Sa、β-溶血性链球菌属BHS、牛棒状杆菌Cb），HEX（念珠状链杆菌Sm、柠檬酸杆菌Cr、肺孢子虫Ps），ROX（肺炎链球菌Sp）三个通道检测7种病原菌，另外一套引物探针在CY5通道检测内参DNA。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：检测灵敏度较高，10 CFU可被有效检出。
高效：单管一次可筛查7种病原菌。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
可靠：含内参基因，避免假阴性。
方便：操作简单，一步法检测。
【运输及保存条件】
低温冷冻运输，-20℃保存，有效期1年；使用后仍存放在-20℃，不可反复冻融超过三次。
【产品组分】
A BOX:
| 组分名称 | 装量 |
| Biowing®Bacteria qPCR Reaction Mix | 275 μL×2管 |
| Biowing®Optional Bacteria Primer&Probe Mix | 冻干粉×2管 |
| RNase Free Water | 1.1 mL×2管 |
| 石蜡油 | 1.1 mL×1管 |
B BOX:
| 组分名称 | 装量 |
| 阳性质控1（PC1） | 冻干粉×2管 |
| 阳性质控2（PC2） | 冻干粉×2管 |
| 阳性质控3（PC3） | 冻干粉×2管 |
| RNase Free Water | 1.1 mL×1管 |
注：
（1）阳性质控（PC1）包含4种病原菌核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是金黄色葡萄球菌Sa、念珠状链杆菌Sm、肺炎链球菌Sp、内参DNA。
（2）阳性质控（PC2）包含3种病原菌核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是β-溶血性链球菌属BHS、柠檬酸杆菌Cr、内参DNA。
（3）阳性质控（PC3）包含3种病原菌核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是牛棒状杆菌Cb、肺孢子虫Ps、内参DNA。
【操作步骤】
1. 样本制备
推荐配套使用翼和SPF-Level Mouse/Rat Pathgen DNA/RNA Kit Pro（货号：PRE.M/R-001），此试剂盒提取快速，回收率较高，并提供核酸保护剂（含内部质控），可以对提取过程进行质控，若使用其他提取试剂盒需先自行测试。
2. 产品组分的复溶
A BOX：Biowing®Optional Bacteria Primer&Probe Mix先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5 s，室温放置5-10 min备用。
| A BOX： | 每管需加入RNase Free Water量 |
| Biowing®Optional Bacteria Primer&Probe Mix | 140 μL |
| 注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。 | |
B BOX：阳性质控1（PC1）、阳性质控2（PC2）、阳性质控3（PC3）先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5 s，室温放置5-10 min备用。
| B BOX： | 每管需加入RNase Free Water量 |
| 阳性质控1（PC1） | 44 μL |
| 阳性质控2（PC2） | 44 μL |
| 阳性质控3（PC3） | 44 μL |
| 注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；阳性质控务必与A BOX分开保存，防止污染，复溶后立即通风并喷洒酒精，以防气溶胶污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。 | |
3. qPCR 反应液的准备
（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做单孔。
反应孔数=3个阳性质控+1个阴性质控+样本数
（2）根据反应孔数计算所需的Biowing®Bacteria Probe qPCR Mix总量（需有1孔的加样损失量）：
Biowing®Bacteria Probe qPCR Mix=（反应孔数+1）×15 μL
（3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：
| 组分/样品管 | Biowing®Bacteria qPCR Reaction Mix (µL) | Biowing®Optional Bacteria Primer&Probe Mix
(µL) |
总体积
(µL) |
| 1孔 | 10 | 5 | 15 |
| N孔
（反应孔数+1） |
10N | 5N | 15N |
4. qPCR 反应体系及反应条件
（1）震荡混匀Biowing®Bacteria Probe qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装15 μL qPCR Mix。
（3）向已分装过qPCR Mix的反应管中加入15 μL石蜡油。
（4）向反应管中加入样品，3,000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：
| 组分/样品管 | 待测样品管
(µL) |
阳性对照管1
(µL) |
阳性对照管2
(µL) |
阳性对照管3
(µL) |
阴性对照管
(µL) |
| Biowing® Bacteria Probe
qPCR Mix |
15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| RNase Free Water | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| Sample | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 阳性质控1（PC1） | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| 阳性质控2（PC2） | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 |
| 阳性质控3（PC2） | 0 | 0 | 0 | 5 | 0 |
PCR 仪设置以宏石SLAN-96S为例，先新建并保存程序项目，选择定性/绝对定量模式，反应体系20 µL，选择FAM、HEX、ROX、CY5通道，按照下表设置程序进行保存：
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | |
| 1 | 逆转录 | 1 | 55℃ | 15 min |
| 2 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 s |
| 3 | 变性 | 35/40 | 95℃ | 10 s |
| 退火与延伸 | 60℃ | 30 s | ||
| 60℃延伸时收集荧光信号 | ||||
| 通道选择：样本检测通道-FAM、HEX、ROX；内参检测通道-CY5。宏石SLAN-96S荧光定量 PCR 仪不需 ROX 校准。若存在部分荧光定量PCR仪无CY5通道，即不分析该通道。 | ||||
注：样本类型为粪便/盲肠内容物时变性、退火/延伸进行35个循环扩增，其他样本类型变性、退火/延伸进行40个循环扩增。
【阈值设置】
以宏石SLAN-96S为例，常用选项中扩增曲线算法选择相对荧光值法-log，基线设置3-15个循环。
（1）按照机器的自动阈值或者手动调整阈值线将阳性质控（PC）各通道的Ct值定为≤32，根据该阈值线进行检测样本结果的判定。
【结果判读】
以宏石SLAN-96S为例，根据样本（FAM/HEX/ROX）Ct值判定是否发生病原菌感染，具体标准如下：
| PCR 模板 | 样本（FAM/HEX/ROX） | 判定说明 |
| 阳性对照
（1、2、3） |
≤32 | 阳性成立 |
| ＞32 | 阳性不成立 | |
| 阴性对照 | ＞35（粪便/盲肠内容物） | 阴性成立 |
| ＞40（组织、血液、垫料/粉尘） | ||
| 待测样品 | ≤35（粪便/盲肠内容物） | 阳性成立 |
| ≤40（组织、血液、垫料/粉尘） |
注：
- 样本阳性判断标准为：
（1）粪便/盲肠内容物样本Ct值≤35时，判定为阳性。其中FAM通道Ct值≤35时，样本可能感染金黄色葡萄球菌Sa、β-溶血性链球菌属BHS、牛棒状杆菌Cb中的一种或几种；HEX通道Ct值≤35时，样本可能感染念珠状链杆菌Sm、柠檬酸杆菌Cr、肺孢子虫Ps中的一种或几种；ROX通道Ct值≤35时，样本感染肺炎链球菌Sp。
（2）组织、血液、垫料/粉尘样本Ct值≤40时，判定为阳性。其中FAM通道Ct值≤40，样本可能感染金黄色葡萄球菌Sa、β-溶血性链球菌属BHS、牛棒状杆菌Cb中的一种或几种；HEX通道Ct值≤40，样本可能感染念珠状链杆菌Sm、柠檬酸杆菌Cr、肺孢子虫Ps中的一种或几种；ROX通道Ct值≤40，样本感染肺炎链球菌Sp。
（3）不同机器的检测灵敏度不同，不同样本类型性质不同，建议使用该系列试剂盒检测样本前，利用SPF样本进行适应性验证后制定阳性判断标准。
- 若各通道有阳性出现，建议进一步使用鉴定试剂盒进行单一病原体感染确认：
（1）FAM通道阳性：使用SPF.M/R-OBF-004试剂盒，对三种可能感染的病原菌（金黄色葡萄球菌Sa、β-溶血性链球菌属BHS、牛棒状杆菌Cb）进行确认。
（2）HEX通道阳性：使用SPF.M/R-OBH-005试剂盒，对三种可能感染的病原菌（念珠状链杆菌Sm、柠檬酸杆菌Cr、肺孢子虫Ps）进行确认。
- 检查内参通道扩增是否正常，内参扩增不正常，表明核酸抽提过程有误或者PCR反应未正常进行，需重复检测。
【注意事项】
由于PCR反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生核酸污染。
- 建议分区操作
（1）A区：（洁净区）配制Mix和qPCR阴性加样，建议在超净工作台完成，并配套干净器具及无菌无酶耗材专用于体系配制。
（2）B区：（核酸提取及加样区）样本DNA/RNA提取，建议在超净工作台完成，若无超净工作台请通风状态下提取并立即消杀，需配套专用于核酸提取的器具，并在每次提取后对环境和器具进行核酸消杀处理；加样区，按照先加待测样本，后加阳性对照的顺序加样，在qPCR反应板上阳性对照的排布应远离待测样本孔和阴性对照；同样需配套专用于加样的仪器，并在每次加完样后进行核酸消杀处理。
（3）C区：（核酸扩增区）此区域放置荧光定量PCR仪及相关电脑进行数据处理，同样需定期进行核酸消杀。
- 其他
（1）由于B BOX含阳性质控，为避免试剂受到核酸污染，A、B BOX请分开储存。
（2）每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
（3）qPCR反应板封膜或盖盖子时需反复压紧。
（4）上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底。
（5）盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
有技术问题，欢迎电话咨询：021-33559491
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