描述

【产品规格】

MtDNAcn 50   50 * 3 Reaction

【产品说明】

线粒体是细胞的“能量工厂”和自由基代谢中心，线粒体功能与线粒体DNA（mtDNA）的数量和质 量紧密相关。线粒体DNA的数量，即线粒体DNA拷贝数。mtDNA拷贝数变异引起线粒体功能紊乱，与衰 老及多种疾病如糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等密切相关。细胞基因组DNA抽提试剂盒获得 的DNA中包含了基因组DNA和线粒体DNA。研究人员一般利用每个细胞中线粒体DNA拷贝数（例如：300 拷贝/细胞）作为一个相关研究参数。

外周血游离线粒体DNA（circulating cell free mitochondrial ，ccfmtDNA）：是血液中游离细胞外的线粒 体DNA，其来源可能有内源性和外源性两条途径，一方面源自于体内肿瘤组织的凋亡、坏死或肿瘤细胞的 内分泌作用；另一方面可能来源于体外凝血过程中白细胞的释放。ccfmtDNA可作为一种非侵袭性的潜在 适用性较大的肿瘤标志物。科研人员一般利用每毫升血液或每毫升血清中游离线粒体DNA拷贝数（例如：

300 拷贝/mL全血、300 拷贝/mL血清）作为一个相关研究参数。

游离线粒体DNA抽提注意事项：

1. 使用EDTA抗凝采集管采集新鲜血液样本，肝素抗凝不可使用。
2. 需要定量全血样本使用量（2 mL或3mL）。
3. 血液样本采集并定量后，30 分钟内分离血清。3000-3500 转/分钟，离心3 分钟。
4. 分离后的血清建议立即使用游离DNA抽提试剂盒进行抽提。如无条件立即抽提，请将分离后的血清储 存于-20℃冰箱。

本产品试剂盒采用双色荧光 qPCR（FAM+HEX）检测线粒体DNA拷贝数，提供已知线粒体DNA拷贝数 的标准品及校正品。利用标准品构建标准曲线，校正品校正后进行绝对定量，检测对象为细胞DNA样本、 游离DNA样本。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输， -20℃保存，有效期 1 年，冻融以后，4℃保存，有效期1周。

【产品组分】

 

组分名称	MtDNAcn 50	储存条件
Biowing®Mitochondrial Detection Mix	780 µL×2管	-20℃,避光
Primer&Probe	570 µL×2管	-20℃,避光
Standard A	100 µL	-20℃
Standard B	50 µL	-20℃
Paraffin oil	1000 µL	4℃
RNase Free Water	100 µL	4℃

 

 

 

注：

本试剂盒提供试剂，使用前请上下轻柔颠倒十次混匀，后低速离心、小心开启。避免起泡。

Standard A是已知线粒体DNA拷贝数的标准品，用于构建标准曲线。

Standard B是已知线粒体DNA拷贝数的校正品，经过计算可得出校正系数。

【操作步骤】

1. 样品质控及使用

DNA纯度A260/A280 ≈ 1.8 ，浓度标化为10 ng/µL，上样2 µL 。每个样本做3个重复。

2. 标准品使用

标准品浓度标化为20 ng/µL ，以两倍梯度稀释，形成3个浓度梯度（原液、2倍稀释、4倍稀释后分别得 到DNA浓度为20 ng/µL 、10 ng/µL 、5 ng/µL的DNA溶液），每个浓度梯度3次重复，上机后绘制标准曲 线。已知拷贝数的标准品分别形成线粒体基因和内参基因两条标准曲线。校正品浓度标化为10 ng/µL ，直 接原液上样2 µL。

3. qPCR反应液的准备

 

（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3个重复孔。

反应孔数=（3个标准品）×3个梯度+（ 1个校正品 +阴性质控 +样本数）× 3

（2）根据反应孔数计算所需的 Mix 总量（含有 1孔的加样损失量）：

Mix =（反应孔数+1）× 18 μL

（3）各试剂放 2-8℃条件下融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：

 

组分/样品管	1人份	N人份
Biowing®Mitochondrial Detection Mix	10.4	10.4 N
Primer&Probe	7.6	7.6 N

 

4. 加样

 

（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

（2）向每孔反应管中分装 18 μL qPCR Mix。

（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入10 μL石蜡油。

（4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：

 

PCR模板	qPCR Mix	总体积
样  本 （模板上样量20 ng）2 μL	18 μL	20 μL
标准品 （模板上样量40 ng）2 μL	18 μL	20 μL
标准品 （模板上样量20 ng）2 μL	18 μL	20 μL
标准品 （模板上样量10 ng）2 μL	18 μL	20 μL
校正品 （模板上样量20 ng）2 μL	18 μL	20 μL

 

 

 

注：盖上八联管盖或者光学膜后盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要 在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底；充分震荡 混匀后，再短时低速离心，将管盖和管壁的残留液体收集至底，如有气泡，需将气泡排尽。

5. qPCR反应条件

PCR仪设置以 ABI 7500为例，其他型号定量PCR仪应通过标准品进行参数校正或咨询专业技术人员。

 

	步骤	循环数	温度	时间
1	预变性	1	95℃	2 min
2	变性	40	95℃	15 s
	退火		56℃	1 min
	延伸		72℃	30 s
温度选择：72℃延伸时收集荧光信号
通道选择：线粒体拷贝检测通道-FAM；内参基因拷贝检测通道-HEX

 

【基线设置】

1. 线粒体拷贝检测扩增曲线基线设定：以标准品基线设定线粒体基线，将基线设定为3~9个循环。
2. 内参基因拷贝检测扩增曲线基线设定：以标准品基线设定内参基线，将基线设定为3~9个循环。

 

【阈值线设置】

1. 线粒体拷贝检测扩增曲线阈值设定：以标准品的Ct值设定线粒体扩增曲线阈值，将3梯度标准品线粒体 的Ct值定为16-20 。
2. 内参基因拷贝检测扩增曲线阈值设定：以标准品的Ct值设定内参扩增曲线阈值，将3梯度标准品内参的 Ct值定为24-28。

说明：

标准品、校正品的线粒体拷贝数，请咨询上海翼和应用生物技术有限公司。产品批次不同，线粒体 DNA拷贝数会有差异。

 

【附录】

1. 细胞线粒体拷贝数计算方法：

将已知拷贝数的标准品原液，2倍梯度稀释后的3个浓度梯度构建标准曲线，纵坐标Y为Log2 上样量， 横坐标X为平均Ct值，分别绘制线粒体基因和内参基因的两条标准曲线，并添加线性趋势线，导出拟 合方程。

图示：

表1 标准品线粒体通道Ct值

DNA总量		10 ng	20 ng	40 ng
X坐标	Ct值	23.015	21.876	20.833
Y坐标	Log2上样量	3.321928095	4.321928095	5.321928095

 

线粒体标曲
6 5 4 3 2 1 0	y = -0.916x + 24.39 R² = 0.9994
20.5               21               21.5               22               22.5               23               23.5

 

表2 标准品内参通道Ct值

DNA总量		10 ng	20 ng	40 ng
X坐标	Ct值	30.24	29.2	28.145
Y坐标	Log2上样量	3.321928095	4.321928095	5.321928095

 

内参标曲
6 4 2 0	y = -0.9546x + 32.193 R²= 1
	28             28.5            29            29.5            30            30.5

 

 

将已知拷贝数的校正品对应基因Ct值分别代入标准品的两条标准曲线的方程中，得到的数值相比得到 一系数K1，计算校正品的实际测量值（K1*标准品 mtDNAcn）。根据公式，校正品 mtDNAcn/（K1* 标准品 mtDNAcn）得到样本计算时的校正系数K2。

例如：假定标准品线粒体DNA拷贝数为300，校正品线粒体DNA拷贝数为380。

 

 

表3 校正系数计算过程

校正品	线粒体Ct值	内参Ct值
三重复的平均值Ct值(x)	21.9	29.5
标准曲线	y = -0.916x + 24.39	y = -0.9546x + 32.193
Log2上样量(y)	4.3296	4.0323
相对上样量(2y)	20.1067	16.3623
校正品比值K1	20.1067/16.3623=1.2288
标准品线粒体DNA拷贝数	300
校正品线粒体DNA拷贝数	380
qPCR法校正品测量值	300*1.2288=369
校正系数K2	380/369=1.0298

 

将样本的线粒体DNA Ct值和内参基因Ct值分别带入标准曲线方程，得到的数值相比得到样本系数 K3，根据公式K3*K2*标准品 mtDNAcn，即可对样本线粒体DNA拷贝数进行绝对定量。（K3*K2为样 本校正后系数）。

表4 样本的线粒体DNA拷贝数

样本	线粒体Ct值	内参Ct值
三重复的平均值Ct值(x)	21.3	29.3
代入标准曲线方程(y)	4.8792	4.22322
相对上样量(2y)	29.4297	18.6774
样本系数K3	1.5757
样本校正后系数（K2*K3）	1.5757*1.028=1.6227
样本线粒体DNA拷贝数	1.6227*300=487

 

2. 游离线粒体DNA拷贝数计算方法

按照以上方法计算出样本中线粒体DNA拷贝数。

按照实际样本的使用量及游离DNA抽提时样本使用量换算出1mL样本中游离线粒体DNA拷贝数。

例如：实际利用2 mL全血分离0.8 mL血清后抽提游离DNA，获得20 µL DNA溶液，标化后，取2 µL作为 PCR模板。通过标准曲线计算得知反应管中存在50拷贝线粒体DNA，则1mL全血中游离线粒体DNA拷贝数 为：(50*(20/2) )/2=250拷贝/mL。