描述

多重长片段PCR打断建库技术应用于QTL精细定位，对少量近等基因系样本进行较大区间（50-200kb）的序列分析，解决加密标记无法找到多态性标记的问题，可对目标区域内的候选基因进行序列分析，挖掘功能SNP，为开发功能分子标记提供支持。而直接一代测序成本相对较高，现有的高通量序列分析技术（扩增子测序、液相捕获等）对50-200kb区间的重测序时由于样本量通常比较小，平均到每个样本的成本也相对较高。为了解决这一问题，上海翼和生物基于多重PCR捕获技术，自主研发了长片段PCR打断建库技术，很大程度上降低了对50-200kb目标区间捕获建库的成本。

应用方向:

农口：全基因组 SNP 基因型分析；QTL 定位及基因定位；发现优良等位变异；开发功能标记；定制育种 Panel；分子标记辅助选择育种；遗传材料前景及背景选择；全基因组选择；亲缘关系鉴定、DNA 指纹图谱、品种鉴定；遗传多样性评价；群体遗传结构分析。

技术原理

上海翼和生物基于自主知识产权的多重PCR捕获技术，针对较大目标区间，自主研发了多重长片段PCR打断建库技术。50-200kb的目标区间常规多重PCR捕获建库需要250重-1000重扩增反应，引物费用昂贵。多重长片段PCR打断建库技术，单个扩增区间为3kb，有效区间为2.5kb，0.5kb的片段是为了满足扩增片段的重叠，保证整体覆盖度。50-200kb区间只需要合成的引物降低为20对-80对，降低了捕获建库的成本。多重长片段PCR捕获目标片段以后，进行超声打断，并建立DNA文库，在主流二代测序平台Illumina X10上机测序，数据下机之后通过生信分析，获取目标区间核苷酸变异信息。

多重长片段捕获测序

技术路线

1. 高同源区段SNP分型/重测序

高同源区段在无法获得特异性PCR产物的情况下，测序获得的序列是多个分子的混合结果。因此，人类高同源基因SNP分型、多倍体物种SNP分型，给遗传学带来挑战。使用长PCR捕获其单一片段，能够清晰有效的提出同源片段的干扰。

描述

多重长PCR建库技术能直接跨过高同源区设计引物，读到目的片段核苷酸的完整序列，可作为HLA分型最直接、最精确、最可靠的方法。可用于对新发现的HLA特异性进行DNA序列分析。

对大片段p450基因测序，细胞色素P450基因是庞大、复杂的超基因家族，广泛存在于动物、植物、细菌真菌等细胞内”，通过多重长片段PCR建库技术对P450基因进行测序分析，可研究其基因的多态性。

线粒体与染色体DNA有较强的同源性，通过使用长片段PCR捕获建库技术检测线粒体DNA。

应用方向：高同源区段重测序、HLA分型、大片段p450基因测序、线粒体测序

2. 少量样本和长片段捕获测序

靶向捕获测序中，采用芯片捕获容易带来较高的基础设计与合成成本，在少量样本测序中难以摊薄。而采用长片段捕获，仅需一对引物的设计与合成费用，经济高效。

描述

多重长PCR建库技术，适用于少量样本的连续或不连续50-200kb目的区间进行高深度目标区域区域重测序，获取变异信息（SNP和Indel）。主要用于QTL区间内标候选区段的重测序。

基因编辑时，当基因组序列中间部分发生较大变化无法在此范围设计引物时，使用长PCR建库技术跨过变化区段设计引物，将可能发生变化的区域进行全覆盖扩增测序；可用于基因编辑和基因敲入的背景鉴定。

由于传统检测方法的限制，单个或多个外显子大片段的缺失/重复往往被忽视。因此，使用多重长片段PCR捕获建库技术可将包括内含子和外显子在内的全部序列进行测定，作为一种检测基因的多外显子大片段缺失/重复的方法。

应用方向：QTL区间内标候选区段的重测序、少量样本50-200kb区间重测序、大片段缺失的检测

 

翼和特色：

1.多重长PCR捕获建库技术，完美结合了长PCR和多重PCR，吸收了两种方法的优点，首次挑战并建立了一种新的靶向捕获建库二代测序的方案。

2.能完成扩增大于5kb的DNA片段；

3.平均覆盖度达到99%以上；

4.能捕获50-200kb区段；