描述

数字PCR低频突变与线粒体DNA拷贝数变异检测

一、数字PCR低频突变检测

【项目介绍】

低频突变是指突变等位基因在大量野生型背景中所占比例较低的遗传变异，常见于肿瘤液体活检、耐药突变监测、FFPE微量样本、细胞系混合样本、基因编辑低比例突变以及模型构建过程中的亚克隆筛查。传统Sanger测序和常规qPCR在低突变丰度背景下容易受到背景噪声、扩增偏倚和定量标准曲线的影响，而高深度测序虽可实现多位点分析，但在单个位点快速验证、低频阳性复核和绝对定量方面仍需结合更直接的检测手段。

本项目采用数字PCR技术对已知SNV或小片段插入缺失突变进行定量检测。检测体系将反应液分配至大量独立微反应单元中，使突变模板和野生型模板在分区内独立扩增，并通过突变型探针与野生型探针的双通道荧光信号完成分群判读。系统根据阳性分区数进行Poisson校正，直接输出突变型拷贝数、野生型拷贝数和突变等位基因频率（variant allele frequency, VAF）。与相对定量方法相比，数字PCR不依赖标准曲线，适合低丰度突变的绝对定量、动态监测和阴阳性边界样本复核。

低频突变检测的关键不只是“能否检出”，还包括阴性背景下假阳性滴度、最低空白限（LoB）、最低检出限（LoD）、最低定量限、输入DNA量以及突变阳性分区的重复性。因此，本项目在检测前可根据目标位点建立野生型阴性背景、阳性梯度标准品和空白对照，并结合分区数、荧光分群质量和重复孔一致性进行综合判定，避免单纯依据平台理论灵敏度进行过度解释。

图1 低频突变数字PCR检测原理示意图

【检测对象】

• 已知低频SNV或小片段插入缺失突变，如EGFR、KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA等热点位点，也可根据客户提供的基因坐标进行定制开发。

• 血浆/血清来源cfDNA、FFPE组织DNA、新鲜或冻存组织DNA、培养细胞基因组DNA、细胞系混合样本及基因编辑样本。

• 适用于人源样本及常见模式动物样本，需明确物种、参考基因组版本、目标坐标、参考碱基和突变碱基。

【适用范围】

应用方向	说明
低VAF突变定量	对已知突变位点进行绝对拷贝数和VAF计算，适合低丰度阳性样本复核。
液体活检与耐药监测研究	用于血浆cfDNA中EGFR T790M、KRAS等耐药或驱动突变的研究性检测。
NGS/qPCR结果验证	对测序发现的低频候选突变进行单个位点快速验证，辅助排除测序噪声。
细胞模型/混样评估	用于细胞系低比例突变、亚克隆筛查、混样污染或基因编辑突变比例评估。

【合作方式与样本要求】

• 客户提供目标突变位点信息，包括基因名称、参考基因组版本、染色体坐标、参考/突变碱基或突变序列，最好同时提供上下游约200 bp序列。

• 样本可提供提取好的DNA或原始样本。基因组DNA建议总量≥50 ng；cfDNA和FFPE DNA可根据样本量尽量提供，低输入样本需增加重复孔并降低定量承诺。

• 建议同步提供野生型阴性样本、突变阳性标准品或已知阳性样本，用于阈值设定、背景评估和LoD验证。

• DNA样本建议4 °C短途运输或−20 °C保存运输；血浆和组织样本按常规核酸检测样本运输要求执行，避免反复冻融。

【结果输出】

报告可输出突变型拷贝数、野生型拷贝数、总目标拷贝数、VAF、阳性/阴性判读、重复孔CV、二维荧光分群图及质控说明。若用于正式方法学验证，可进一步给出线性范围、LoB、LoD、重复性和批间一致性结果。

【结果展示形式示例】

样本类型	输出指标	结果解释
野生型阴性背景	突变通道背景阳性分区数、WT拷贝数	用于确定LoB和阈值，评估假阳性背景。
低频阳性标准品	Mut拷贝数、WT拷贝数、理论VAF与实测VAF	用于验证不同突变丰度下的检出能力和定量线性。
待测	Mut拷贝数、WT拷贝数、VAF、置信区间	结合LoB/LoD、重复孔一致性和分群质量给出判读。

二、数字PCR线粒体DNA拷贝数变异检测

【项目介绍】

线粒体DNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number, mtDNA-CN）反映细胞内线粒体基因组的相对含量，是评价线粒体生物发生、能量代谢状态、氧化应激反应、药物毒性和疾病相关线粒体功能改变的重要指标。不同组织、细胞类型、处理条件和疾病状态下，mtDNA拷贝数可能出现升高或降低，因此常被用于细胞功能研究、肿瘤与代谢疾病研究、衰老相关研究以及细胞模型质量评价。

传统qPCR通常通过mtDNA靶点与核基因内参的ΔCt或相对比值推算mtDNA含量，但其结果容易受到扩增效率、标准曲线、Ct阈值和批间差异影响。数字PCR通过大量分区终点扩增实现绝对定量，可同时检测mtDNA靶点和核基因单拷贝内参，并直接根据阳性分区数计算两类靶标的拷贝数。对于二倍体细胞样本，可按“mtDNA拷贝数/细胞 = 2 × mtDNA靶点拷贝数 / 核单拷贝基因拷贝数”计算，也可输出mtDNA/nDNA相对比值用于不同处理组或不同样本间比较。

本项目可根据物种和样本类型设计mtDNA靶点与核基因内参检测体系。靶点选择时优先考虑ND1、ND4、CYTB等线粒体编码区，并对核基因组中的线粒体同源片段（NUMTs）进行序列排查。由于D-loop区域可能受到复制中间体、7S DNA或区域特异性扩增偏差影响，不建议将其作为唯一的mtDNA拷贝数定量靶点。对于血液、组织或细胞样本，需保持样本处理和DNA提取流程一致，以减少不同类型DNA回收效率差异带来的系统偏倚。

图2 线粒体DNA拷贝数变异数字PCR检测原理示意图

【检测对象】

• 培养细胞、原代细胞、干细胞、类器官、组织样本、血液细胞及提取后的基因组DNA。

• 可用于人、小鼠、大鼠及其他已知线粒体基因组序列的样本。

• 适用于药物处理、氧化应激、代谢调控、疾病模型、细胞衰老和线粒体功能相关研究样本。

【适用范围】

应用方向	说明
mtDNA绝对拷贝数检测	输出每细胞mtDNA拷贝数或单位DNA中的mtDNA/nDNA比值。
功能评价	比较药物、应激、培养条件或基因干预前后mtDNA含量变化。
疾病和模型样本比较	用于肿瘤、代谢、神经退行性、衰老等研究中的组间差异分析。
细胞质量控制	评价长期传代、冻融、诱导分化或细胞模型构建过程中的线粒体拷贝数变化。

【合作方式与样本要求】

• 客户提供样本类型、物种、处理分组和预期比较方式。若已有目标靶点或内参基因要求，可一并提供。

• 细胞样本建议≥1×10^5个细胞；组织样本建议≥10 mg；提取好的DNA建议总量≥50 ng，浓度和纯度满足常规PCR要求。

• 同一项目中应尽量统一采样、裂解、DNA提取和定量流程，避免因线粒体DNA与核DNA回收效率不同造成假性差异。

• DNA样本建议4 °C短途运输或−20 °C保存运输；细胞或组织样本可采用干冰运输，避免反复冻融。

【结果输出】

报告可输出mtDNA靶点拷贝数、核基因内参拷贝数、mtDNA/nDNA比值、mtDNA拷贝数/细胞、重复孔CV、置信区间、组间相对变化倍数及质控说明。若用于方法学验证，可进一步提供靶点特异性、扩增效率一致性、重复性、线性范围和不同输入量下的稳定性评估。

【结果展示形式示例】

样本类型	输出指标	结果解释
正常对照组	mtDNA/nDNA比值、mtDNA copies/cell	建立本批次样本的参考范围。
处理组或疾病组	相对对照组的升高/降低倍数	判断线粒体拷贝数是否发生变化。
重复样本/复孔	CV、置信区间、分群图	评价数据稳定性和分区判读质量。